原发中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤临床病理 分子遗传学改变及其与预后的相关性

来源：中华病理学杂志

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摘要

目的：探讨原发中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的临床病理、免疫表型、与EB病毒相关性及分子遗传学改变，并分析相关预后因素。

方法：回顾性分析30例原发中枢神经系统DLBCL临床资料；采用HE染色及免疫组织化学EnVision法染色观察肿瘤组织病理学特点和免疫表型特征；原位杂交技术检测肿瘤EB病毒编码mRNA表达情况；荧光原位杂交技术检测肿瘤组织中bcl-2、bcl-6和C-MYC基因重排，并对所有患者进行随访。

结果：30例患者，男性18例，女性12例，男女比例1.5∶1.0。中位年龄53(24～76)岁。患者以局灶性神经功能缺损为主要临床表现。形态学以中心母细胞型为主，可见凝固性坏死及血管中心性-血管破坏性生长，有较多核分裂象和凋亡小体，常见血管周淋巴细胞套。免疫表型：生发中心(GCB)型6例，非GCB型24例，bcl-2、bcl-6、C-MYC蛋白表达率分别为53.3%(16/30)、80.0%(24/30)、20.0%(6/30)。荧光原位杂交检测bcl-2、bcl-6、C-MYC基因重排阳性率分别为3.3%(1/30)、16.7%(5/30)、6.7%(2/30)。仅1例检测出EBER阳性。国际预后指数(IPI)评分：0～1分19例(63.3%)，2～3分11例(36.7%)。患者性别、民族、初次就诊时存在B症状、发病部位、血清乳酸脱氢酶、血沉、β2微球蛋白含量、bcl-2蛋白表达、bcl-6蛋白表达、Ki-67阳性指数及分子遗传学改变与预后均无统计学意义；发病年龄≤60岁组、功能状态(PS)评分0～1分组及IPI评分0～1分组患者预后较好(P<0.05)；免疫分型GCB型组预后优于非GCB型组(P＝0.013)；术后加用大剂量甲氨蝶呤或阿糖胞苷化疗组的预后优于其他治疗方式组(P＝0.006)，术后电话随访，平均随访时间13.6个月，中位生存时间10个月，其中16例在1年内死亡，1年生存率为46.7%。

结论：年龄、临床功能状态评分、IPI评分、免疫分型及治疗方式与预后相关，原发中枢神经系统DLBCL患者病程进展迅速，1年内为死亡的高发时间，手术切除加用大剂量甲氨蝶呤或阿糖胞苷化疗是目前最佳的治疗方式。

正文

原发中枢神经系统(CNS)淋巴瘤是指原发于颅内、眼、脊髓和软脑膜等部位的非霍奇金淋巴瘤，且在确诊后6个月内无CNS以外其他部位淋巴结或淋巴组织的侵犯、器官受累[1]。原发CNS淋巴瘤是一类相对罕见的高侵袭性恶性肿瘤，约占全部颅内原发肿瘤的3%[2]。原发CNS弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的原发CNS淋巴瘤，WHO关于淋巴造血系统肿瘤分类中将原发CNS-DLBCL作为非特指的DLBCL中的一个亚型单独列出[3]。该肿瘤具有中-高度侵袭性、生长迅速的特点，但在临床表现、形态学特点、免疫表型和遗传学特征等方面存在很大异质性，目前临床广泛应用国际预后指数(IPI)评估其预后，但研究发现即使IPI指数相同，患者预后仍存在较大差异[4]，采用经典的DLBCL治疗方案，20%～40%患者无法治愈或短期内复发[5]。为更好地评价原发CNS-DLBCL患者基因的异常情况及与临床预后的相关性，我们对原发CNS-DLBCL患者进行免疫分型，应用分裂间期荧光原位杂交(FISH)技术对患者石蜡组织中bcl-2、bcl-6和MYC的基因重排情况进行检测，观察原发CNS-DLBCL患者的临床病理、免疫表型、与EB病毒相关性及分子遗传学改变，并分析相关预后因素。

资料与方法

1．资料来源：

收集1月至12月期间新疆医科大学第一附属医院病理科诊断为原发CNS-DLBCL手术切除标本30例，约占同期DLBCL的7.8%(30/386)。患者以CNS受损为首发症状，所有病变均局限于颅内，血常规及骨髓穿刺均未发现白血病征象，影像学检查排除其他部位淋巴瘤转移至CNS。所有患者人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体均为阴性且既往无其他恶性肿瘤病史、自身免疫性疾病及器官移植史。所有切片由两位淋巴瘤专业组病理医师参照WHO造血与淋巴组织肿瘤分类诊断标准重新阅片，在患者知情同意情况下进行电话随访，获得完整的临床资料和随访资料。随访内容主要包括年龄、性别、乳酸脱氢酶(LDH)水平、临床分期、IPI评分、总生存期。总生存时间是指疾病确诊到淋巴瘤引起的死亡或随访终止，与本病不相关的死亡算为截尾。

2．免疫组织化学染色：

采用EnVision法，所用抗体及工作浓度见表1。所有病例均为石蜡包埋组织，4 μm切片，常规脱蜡、水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，pH 9.0的EDTA修复液进行抗原微波热修复，一抗4 ℃过夜，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精对比染色。反应性增生淋巴结为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。判读标准参照文献[6,7]，bcl-2、MYC阳性细胞百分数分别以70%、40%为临界值。

3．原位杂交检测EB病毒：

采用地高辛标记的EBER探针(ISH-6021，购自丹麦Dako公司)检测EB病毒编码mRNA。以已知阳性的鼻咽癌组织为阳性对照，以淋巴结反应性增生为阴性对照，以PBS代替杂交液做空白对照。

4．间期FISH技术检测bcl-2、bcl-6、C-MYC基因异常：

双色分离重排探针(包括bcl-6探针：30-231050，C-MYC探针：30-191096)和双色双融合重排探针(IgH/bcl-2探针：30-191018)，购自美国Vysis-Abbott公司。操作步骤和方法参照文献[2，8]，FISH 2.0软件进行结果分析。结果判读标准参照文献[9,10]：每个病例选取10处视野，每处视野计数100个细胞，不计数重叠细胞，计算10个视野中的阳性细胞百分数。结果判定：以5例反应性增生的淋巴结标本假阳性信号几率的均数加3倍标准差为正常值上限，双色分离探针bcl-6和C-MYC重排的正常值上限分别为3.0%和2.1%，双色双融合探针bcl-2/IgH重排的正常值上限为20.0%。

5．统计学方法：

采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析，单因素分析运用秩和检验和χ2检验，非正态分布计量资料运用中位数及四分位数间距表示，单因素生存分析采用Kaplan-Meier法，各组间生存率比较采用Log-rank分析，多因素生存分析运用Cox回归模型，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．临床特征：

本组病例男性18例，女性12例，男女比例为1.5∶1.0；平均年龄52岁，中位年龄53(24～76)岁。≤60岁组12例(40.0%，12/30)，>60岁为18例(60.0%，18/30)。患者以局灶性神经功能缺损为主要临床表现，其中颅神经功能障碍较多见，如眼睑下垂、失语或偏瘫等。30例患者行影像学检查：病变位于幕上21例(70.0%，21/30)，幕下7例(23.3%，7/30)，幕上幕下均受累2例(6.7%，2/30)。CT扫描示大脑半球内单发或多发斑片状、球团状或团块状影，表现为稍高密度或等密度影。MRI示病灶大多位于脑实质深部近中线附近，以大脑半球、基底节区、胼胝体、第三及第四脑室周围多见。

2．组织病理形态学特征：

30例原发CNS-DLBCL均为手术切除标本。大体观察为灰红色不规则碎渣样组织，无包膜，质软，细腻，呈鱼肉状或凝胶状，出血坏死少见。在病理形态学上该肿瘤具有相对独特的特点：(1)肿瘤细胞弥漫或灶性浸润脑组织，不形成淋巴滤泡样结构；(2)肿瘤细胞呈血管中心性-血管浸润性现象常见，肿瘤细胞在血管周围呈向心性排列且浸润血管有3种形式：①浸润小动脉，肿瘤细胞呈靶环状排列，似洋葱皮样层状构型；②肿瘤细胞在小血管周围呈球状浸润，小球中心血管内皮细胞轻度肿胀，肿瘤细胞不进入血管壁；③肿瘤细胞浸润小血管，呈袖套状，部分破坏并侵入血管壁，致管腔狭窄、闭塞。虽然脑炎也常见炎性细胞呈袖套状浸润血管周围，但炎性细胞呈多样性浸润，而淋巴瘤细胞呈单一性浸润。形态学观察发现26例(85.7%，26/30)肿瘤细胞以中心母细胞样细胞为主(图1)，3例(10.0%，3/30)以免疫母细胞样细胞为主(图2)，1例(3.3%，1/30)以间变细胞型为主(图3)；8例(26.7%，8/30)见肿瘤细胞围绕血管呈套袖状浸润(图4)；3例(10.0%，3/30)见少数散在分布的瘤巨细胞；10例(33.3%，10/30)可见不同程度的点灶状及片状坏死；8例(26.7%，8/30)背景中有数量不等的嗜酸性粒细胞浸润。

图1～4原发中枢神经系统(CNS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组织学形态 HE 高倍放大；图1 中心母细胞型，图2 免疫母细胞型，图3 间变大细胞型，图4 肿瘤细胞浸润和破坏血管壁，围绕血管呈套袖样排列

图5～10原发CNS-DLBCL组织学形态免疫表型 EnVision法；图5 肿瘤细胞围血管，表达CD20 高倍放大；图6 肿瘤细胞表达bcl-6 中倍放大；图7 肿瘤细胞表达bcl-2 高倍放大；图8 肿瘤细胞表达MUM1 低倍放大；图9 肿瘤细胞表达C-MYC蛋白 高倍放大；图10 肿瘤细胞高表达Ki-67高倍放大

图11原发CNS-DLBCL EBER mRNA原位杂交阳性 原位杂交 高倍放大

图12～14原发CNS-DLBCL的基因状态间期 FISH法 ×1 000；图12 bcl-2/IgH 基因发生融合，细胞核内出现2个黄色融合信号及1个橙色信号和1个绿色信号；图13bcl-6 基因发生重排，细胞核内出现1个绿色信号、1个橙色信号和1个黄色融合信号；图14 C-MYC基因发生重排，细胞核内出现1个绿色信号，1个橙色信号和2个黄色融合信号

3．免疫组织化学特点及免疫学分型：

30例肿瘤细胞CD3均阴性。CD10、CD20、MUM1、bcl-6、bcl-2和C-MYC阳性率分别为20.0%(6/30)、100.0%(30/30，图5)、89.2%(25/28)、80.0%(24/30，图6)、53.3%(16/30，图7)和26.7%(8/30，图8)。根据Hans分类法，30例患者中，生发中心(GCB)型6例(20.0%，6/30)，非GCB型24例(80.0%，24/30)。肿瘤细胞表达C-MYC蛋白(图9);肿瘤细胞高表达Ki-67(图10)。

4．EBER原位杂交：

30例中仅1例EBER阳性(图11)。

5．间期FISH：

本组30例患者，检测到基因异常的有8例，其中bcl-2/IgH基因融合1例(图12), bcl-6基因断裂重排5例(图13)，C-MYC基因断裂重排2例(图14)，重排率分别为3.3%(1/30) 、16.7%(5/30)、6.7%(2/30)，未发现同时2种或3种基因异常的患者。bcl-6基因重排与患者年龄和ECOG临床评分相关(P≤0.05)；C-MYC基因重排与患者年龄和β2微球蛋白相关(P≤0.05)；三种基因重排与患者性别、肿瘤个数、血清LDH、血沉、初次就诊时存在B症状、bcl-2蛋白表达及bcl-6蛋白表达并无相关性(P>0.05)，且原发CNS-DLBCL中bcl-6、bcl-2和C-MYC基因遗传学改变与免疫分型无相关性(P>0.05)。

6．临床随访：

本研究中全部病例以电话形式进行追访，自病理确诊之日起计算生存期。随访至8月30日。30例患者中可系统追踪随访病例28例，失访2例。平均随访时间13.6个月。21例死亡，占全组的75.0%(21/28)，其中5例为肿瘤终末期，14例为原发难治，均未达到临床缓解，1例死于循环功能衰竭，1例死于车祸。21例死亡患者中16例于1年内死亡，占76.2%(16/21)，提示原发CNS-DLBCL患者病程进展迅速，1年内为死亡的高发时间。

7．单因素预后分析：

(1)发病年龄：≤60岁组预后优于>60岁组(P＝0.013)；(2)功能状态评分：0～1分组的预后显著优于≥2分组(P＝0.001，图15)；(3)IPI评分：0～1分组预后显著优于≥2组(P＝0.001，图16)；(4)不同治疗方式：手术切除加用大剂量甲氨蝶呤或阿糖胞苷化疗组的预后优于其他治疗方式组(P＝0.006，图17)；(5)免疫学分型：GCB组预后优于非GCB组(P＝0.010，图18)。患者的性别、民族、Ann Arbor分期、初次就诊时存在B症状、发病部位、初诊时血清LDH、血沉、β2微球蛋白含量、组织学分型、bcl-2蛋白表达、bcl-6蛋白表达、Ki-67阳性指数及分子遗传学改变与患者预后差异均无统计学意义(P>0.05)。

图15～18不同因素对原发CNS-DLBCL患者的影响生存曲线图；图15 功能状态评分与预后的关系；图16 国际预后指数(IPI)评分与预后的关系；图17 不同治疗方式与预后的关系；图18 免疫分型与预后的关系

8．多因素预后分析：

本组数据Cox模型多因素分析显示：免疫分型与预后关系密切，差异具有统计学意义(P＝0.012，表2)。

讨论

DLBCL是最常见的B细胞淋巴瘤，具有中-高度侵袭性、生长迅速并在临床表现、形态学特点、免疫表型和遗传学特征等方面存在很大异质性。国内淋巴瘤协作组统计DLBCL发病率高达40%～50%，高于国际25%～30%的发病率[11]。WHO造血与淋巴肿瘤分类中的DLBCL新增了4个亚型，原发CNS-DLBCL为其中一个独立亚型，具有独特的临床病理特征及生物学行为。目前，大多数研究认为这种独特性主要是由分子水平和细胞遗传学水平的异质性引起。这种异质性是肿瘤具有高度侵袭性、易复发转移、产生耐药性的基础。应用FISH技术分析原发CNS-DLBCL患者的bcl-2、bcl-6及C-MYC基因状态及其与患者一般情况、免疫学表型、预后的关系，可以对原发CNS-DLBCL进行更好的分层研究，从而更加有针对性的选择治疗方案，提高患者生存期及生活质量[12,13]。

本组30例原发CNS-DLBCL患者男女比为1.5∶1.0，中位年龄53岁，与既往文献报道相似[14]。本组患者主要表现为颅内压增高和局灶神经系统损害症状。其中22例患者出现恶心、呕吐等颅内压增高的症状，6例出现肢体麻木等局灶神经系统损害症状。2例出现癫痫发作且同时合并焦虑、失眠等精神状态改变。影像学表现为稍高密度或等密度影，瘤周可见以环形为主、宽度约为0.5～3.0 cm不等的指压样低密度水肿带。本组患者中临床诊断为胶质瘤18例、转移癌6例、诊断不明者4例，临床怀疑淋巴瘤的仅2例。仅根据临床及影像学表现，很难做出正确诊断。光镜下肿瘤细胞多呈弥漫浸润性生长，肿瘤组织与周边脑组织分界不清。瘤细胞形态较单一，为中等大小至大细胞。细胞呈圆形、卵圆形，核仁明显，核染色质深浅不一，病理性核分裂象易见。周边脑组织可见出血、点灶状坏死及反应性胶质细胞增生，肿瘤细胞浸润小血管，呈袖套状，部分破坏并侵入血管壁，致管腔狭窄、闭塞。虽然脑炎也常见炎性细胞呈袖套状浸润血管周围，但炎性细胞呈多样性浸润，而淋巴瘤细胞呈单一性浸润，此现象与文献报道一致[15]。

免疫表型分析显示30例中bcl-6阳性24例，bcl-2阳性16例，C-MYC阳性6例。6例为GCB型，24例为非GCB型。免疫学亚型GCB组的预后明显优于非GCB组，与文献报道较一致[8]。统计学分析显示IPI评分对于原发CNS-DLBCL的预后评估有重要意义，IPI评分0～1分的预后明显优于IPI评分2分和IPI评分3分者。另外，对IPI评分中的各项危险因素进行单因素分析，结果显示仅发病年龄与预后有密切关系：即发病年龄>60岁患者预后更差。

bcl-2基因定位于18q21，编码一个具有抗凋亡功能的蛋白，它广泛表达于非成熟B细胞和记忆性B细胞，而不表达于生发中心B细胞。由于t(14；18)重排而使bcl-2表达持续性增加，导致肿瘤性B细胞获得了生存优势，对抗凋亡。相关研究显示[16]，1.7%～22.0%的DLBCL检测出bcl-2基因重排，其重排主要发生在GCB型DLBCL，与免疫分型显著相关，但与预后无关[17,18,19]。本组30例原发CNS-DLBCL病例中bcl-2基因重排的携带者仅1例(3.3%)，该患者免疫学分型为非GCB，随访48个月后患者存活。本组病例未检测出bcl-2多拷贝，研究显示，bcl-2基因多拷贝与治疗效果较差及临床分期较晚有关[16,17,18]。本组病例未检测出bcl-2多拷贝，因此我们的结果无法证实bcl-2基因多拷贝与预后的关系，可能与本组获取阳性样本例数较少有关。

bcl-6基因定位于3q27，编码是一个锌指蛋白，它在人体多种组织内表达，但在淋巴组织中仅表达于生发中心B细胞，表明生发中心的形成依赖bcl-6蛋白的表达。bcl-6基因可因其突变或者染色体重排而活化，参与淋巴瘤的发生。文献报道22.1%～42.9%的DLBCL病例携带bcl-6基因重排[12,16,18]，有研究认为bcl-6重排主要发生在非GCB型DLBCL，本组30例DLBCL病例中，bcl-6重排率为16.7%(5/30)，其中非GCB组中发生率高于GCB组，与文献报道相似，但差异无统计学意义。虽然bcl-6重排组的总生存率低于非重排组，但差异无统计学意义。

关于C-MYC基因重排对免疫学分型及预后的意义，现在尚有争议[19]。本组30例DLBCL中，C-MYC基因重排率为6.7%(2/30)，免疫表型为GCB型，随访时间36个月患者存活。实际上C-MYC基因重排仅为其功能异常的方式之一，近来采用基因表达谱方法进行的研究发现基因表达谱比基因重排检测更能精确说明C-MYC基因的活化状态[20]。因此，对C-MYC及相关基因的异常活化状态进行深入研究，对于DLBCL患者的分层或指导个体化治疗具有重要意义。在DLBCL，伴有C-MYC基因重排的病例，尤其是同时伴有bcl-2和/或bcl-6重排的病例，预后差而且对标准化疗(R-CHOP)反应差[17]。本组病例未检出"双打击"病例，是否存在其他的C-MYC基因异常活化机制值得进一步研究。

本组病例bcl-2、bcl-6及C-MYC基因重排检测率明显低于文献报道。分析原因可能是：(1)DLBCL是高度异质性肿瘤，小样本研究可能导致病例选择偏倚；需要收集大样本病例进行深入广泛的研究加以证实。(2)与石蜡标本前期的取材固定有密切关系，固定时间过长会导致甲醛和组织中蛋白质广泛交联，从而形成牢固的共价键，给后续的预处理和蛋白酶消化带来困难，从而造成杂交位点不能充分暴露，阳性率过低。(3)中国人的DLBCL可能存在着某些与西方人不同的分子遗传学特点。而且我们发现遗传学改变与相应蛋白表达不一致。本组研究中bcl-2蛋白阳性组和阴性组生存期差异无统计学意义(P＝0.350)。本研究结果显示bcl-2、bcl-6及C-MYC基因重排在DLBCL中不具有预后判定意义。可能由于本研究样本量相对小，遗传学改变与预后意义仍需大样本、多中心的研究和验证。

综上所述，我们的研究结果表明，在原发CNS-DLBCL中，发病年龄≤60岁，功能状态评分0～1分，IPI评分0～1分，免疫分型为GCB的患者预后较好，可作为原发CNS-DLBCL患者预后指标。原发CNS-DLBCL患者病程进展迅速，1年内为死亡的高发时间，手术切除加用大剂量甲氨蝶呤或阿糖胞苷化疗是目前最佳的治疗方式。bcl-6基因重排与患者年龄和ECOG评分相关，C-MYC基因重排与患者年龄和β2微球蛋白相关。目前对其大样本研究仍较少，还需进一步的深入研究。

参考文献：（略）

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